做精子畸形試驗ISO10993找權威實驗室上海飛凡13764818040（黃工） 1 范圍 本規范規定了動物精子畸形試驗的基本原則、要求和方法。 本規范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測。 2 引用標準 GB 14924 試驗動物與飼料標準 GB 15193?94 食品安全性毒理學評價程序 3 定義 精子畸形 （sperm malformation） 指精子形態的異常改變。 4 原理 已知精子畸形是決定精子形成的基因發生突變的結果。常染色體和Y-性連鎖基因突變及某些染色體重排，如性-常染色體易位，也可使精子發生畸形。 小鼠精子畸形試驗能評價受試物對精子生成、發育的影響，可檢測受試物在體內對生殖細胞的遺傳毒性作用。 5 試驗的基本原則 通過適當的途徑使動物接觸受試物，經過一定時間后處死動物，取其附睪，制備涂片，經固定、染色，在顯微鏡下計數畸形精子。 6 儀器和器械 生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、表面皿、離心管、小漏斗、吸管、滴管、載玻片、擦鏡紙等。 7 試劑 7.1 1%伊紅染色液 稱取伊紅1g溶于100mL蒸餾水中。 7.2 生理鹽水、甲醇（A.R） 8 實驗動物和飼養環境 常規使用動物是雄性小鼠。6周~8周齡，體重為30g ~35g。 實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規定。 9 劑量分組 受試物至少設三個劑量組。分別取1/2、1/5、1/10或1/20LD50劑量。當受試物的LD50大于5g/kg體重時，可取5g/kg體重為高劑量。另外設陰性（溶劑）對照組和陽性物對照組。常用溶劑為水、生理鹽水、植物油（玉米油、花生油）等。陽性物對照組可采用環磷酰胺40mg/kg/ 每組至少有5只存活動物。 10 染毒途徑和方式 染毒途徑視實驗目的而定。常用途徑為經口灌胃方式。受試物各劑量組、陰性對照組和陽性物對照組的動物，均連續染毒5d，每日一次。一般于首次染毒后的第35d處死動物。 11 試驗方法 11.1 制片 用頸椎脫臼法處死小鼠，剖開腹腔，暴露睪丸，分離兩側附睪，用眼科剪剖開附睪組織，與適量生理鹽水混勻，涂片。 11.2 固定 待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。 11.3 染色 將涂片于1%伊紅染液中染色1h，然后用蒸餾水輕輕沖洗，晾干。 11.4 觀察與計數 首先，在低倍鏡下選擇背景清晰、精子分布均勻、重疊較少的區域，然后，在高倍鏡下觀察結構完整的1000個精子，計數其中畸形的精子。精子畸形主要表現在頭部。按Wyrobeks的分類標準，主要類型有：無鉤、香蕉形、無定形、胖頭、尾折疊、雙頭及雙尾。無尾精子、頭部重疊的或整個與另一個重疊的精子均不計數。判斷雙頭、雙尾精子時，要注意與兩條精子的部分重疊相區別。 12 數據處理和結果判斷 每只動物應按精子畸形類型分別記錄，以便計算各實驗組的精子畸形發生率和精子畸形類型的構成比。 利用Wilcoxon秩和檢驗法和其他適當的統計學方法。將受試物各劑量組精子畸形發生率分別與陰性對照組進行比較。 精子畸形試驗陽性的判斷標準是畸形發生率至少為陰性對照組的倍量或經統計學處理有顯著性差異，并存在劑量-反應關系者。 一般正常小鼠的精子畸形率為0.8%~3.4%，但每個實驗室應有自己穩定的精子自發畸形率。 13 試驗報告 試驗報告應包括以下內容： （1）受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用溶劑； （2）動物種屬和品系、體重、數量、來源（注明合格證號和動物級別）； （3）實驗動物飼養環境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物室合格證號； （4）劑量分組，染毒途徑和方式； （5）試驗方法：簡述操作步驟，所用統計學方法； （6）結果：以列表方式報告受試物對動物精子畸形發生率和精子畸形類型分析的結果 （表1和表2）； （7）結論。 涉及地區：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省